ВІДГУК
офіційного опонента на дисертаційну роботу Близнюк Юлії Миколаївни “Механізми асоціації біологічно активних речовин та їх комплексоутворення з ДНК”, подану на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика (фізико-математичні науки)

Вивчення взаємодії біологічно активних речовин (БАР) з ДНК є центральною проблемою сучасної молекулярної біофізики. Проводиться велика кількість досліджень з метою виявлення хімічних сполук, які мають властивість утворювати комплекси з ДНК і тому потенційно можуть використовуватися як лікарський засіб. Водночас, поряд з інформацією про безпосередню взаємодію БАР з ДНК важливим є також вивчення утворення комплексів молекул БАР між собою (самоасаціація або гетероасоціація). Результати таких досліджень поглиблюють розуміння основних механізмів комплексоутворення різних сполук з макромолекулою ДНК, що закладає основу для поліпшення методів терапії ракових захворювань. З огляду на це тема роботи дисертації Близнюк Юлії Миколаївни “Механізми асоціації біологічно активних речовин та їх комплексоутворення з ДНК” є актуальною і має велике практичне значення. Задача, що ставиться в дисертації, головним чином, пов’язана з доведенням існування водневих зв’язків в комплексах само- та гетероасоціатів молекул біологічно активних речовин та визначення їхньої ролі в стабілізації макромолекулярних комплексів. Для розв’язання поставленої задачі досліджувалися системи, що складалися з таких молекул, як флавінмононуклеотид (FMN), етидіум бромід (ЕВ), теофілін (ТРН), профлавін (PRF), кофеїн (CAF), а також системи, що містили макромолекулу ДНК. Структура усіх цих молекул містить ароматичні кільця, тому внаслідок гідрофобних взаємодій у водних розчинах вони утворюють само- та гетероасоціати у вигляді стопок. Утворення стопко-подібних структур цих сполук було надійно зафіксовано методом ЯМР в роботах інших авторів. Водночас, питання виникнення водневих зв’язків та водних містків між донорно-акцепторними групами цих молекул залишалося невивченим. В представленій дисертації за допомогою методів інфрачервоної спектроскопії та спектроскопії комбінаційного розсіювання, а також методів комп’ютерного моделювання, а саме квантово-хімічних розрахунків та Монте-Карло, проведено детальне дослідження виникнення водневих зв’язків в комплексах само- та гетероасоціатів вищезазначених БАР та визначено ті комплекси, де внесок водневих зв’язків в енергію взаємодії є найбільшим. Дослідження за темою дисертації Близнюк Ю.М. проводилися в рамках планів фундаментальних держбюджетних науково-дослідницьких робіт відділу біофізики Інституту радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усикова НАН України,

а саме НДР: «Молекулярні моделі комплексів біологічно активних речовин з нуклеїновими кислотами за умови мультимодального та конкурентного зв’язування» (№ держ. реєстрації 0107и001079), «Механізми впливу біологічно активних речовин і електромагнітних полів гіга- та терогерцового діапазонів на об’єкти різного рівню організації (біополімери, біомембрани, клітини)» (№ держ. реєстрації 011 Ш 0 10475). Дисертація оформлена згідно вимог МОН України і складається зі вступу, п ’яти розділів, висновків, списку літератури та додатків. Список використаних джерел містить 255 посилання. О б’єм основної частини дисертації складає 137 сторінок. У вступі обґрунтовано актуальність обраної тематики досліджень, формулюється мета роботи, основні задачі, вказується новизна отриманих результатів та їхнє практичне значення. У першому розділі дисертації наведено загальні відомості про ароматичні біологічно активні речовини, зокрема, РМЫ, РШ7, ЕВ, ТРН і САР. Проведено детальний аналіз існуючих експериментальних даних про структуру само- і гетероасоціатів цих молекул. Наведено наявні в літературі експериментальні свідчення про стабілізацію цих комплексів за допомогою водневих зв’язків. На основі зробленого огляду літературних даних обґрунтовано сформульовані у вступі дисертації задачі. У другому розділі описано експериментальні методи дослідження, які використовувалися в дисертації. Серед експериментальних методів інфрачервона (14) спектроскопія, спектроскопія комбінаційного розсіяння (КР) та метод п’єзогравіметрії. Серед розрахункових методів - метод Монте-Карло та квантово-хімічні методи. Окремо описано методику, за якою авторка готувала зразки для експерименту. В третьому, четвертому і п’ятому розділах дисертації представлено оригінальні результати. У третьому розділі описуються результати дослідження самоасоціації флавінмононуклеотиду. Проведено порівняння 14 спектрів РМЫ у нейтральному та у слабокислому середовищі для випадку розчинів та вологих плівок. У випадку зволожених плівок зафіксовано суттєві високочастотні зсуви коливань карбонільних груп 1656 см ' 1 (С 2= 0 ) і 1704 см ' 1 (С 4= 0). Для пояснення цього ефекту досліджено резонансні взаємодії карбонільних коливань у стопках 17МЫ на основі теорії молекулярних екситонів О.С. Давидова. Побудовано залежності частотних зсувів карбонільних груп від кількості молекул у самоасоціаті, які показали, що спостережуване зміщення частоти може відбуватися у випадку як мінімум трьох молекул у стопці. В діапазоні коливань ізоалоксазинового кільця FMN зафіксовано високочастотні зсуви характерних смуг коливань мод, що свідчить про протонування атомів азоту N 1 і N 5. Квантово-хімічний розрахунок зарядів на атомах і порядків зв’язків гіротонованого і негіроторованого ізоалоксазинового кільця дозволив зробити якісний висновок про можливі зміни в константах коливань, які можуть бути викликані протонуванням саме цих атомів.

2

Для визначення ролі води в стабілізації комплексів молекул РМИ проведено дослідження залежності частот і інтенсивностей мод коливань за участі атомів азоту і карбонільних груп С 2- О і С 4Ю від кількості молекул води у плівках. Результати виявили низькочастотні зсуви та збільшення інтенсивностей відповідних смуг коливань, що свідчить про утворення водних містків між донорно-акцепторними групами ізоалоксазинових кілець. Показано, що у нейтральному середовищі ці водні містки формуються у всьому інтервалі сорбції води, а у випадку слабокислого середовища вони утворюються, головним чином, на початку процесу гідратації. У четвертому розділі описуються результати дослідження утворення гетерокомплексів РМИ-ТРН, ТРН-ЕВ, ТРН-РИР та ЕВ-САР. В 14 спектрах системи РМ1Ч-ТРН виявлено високочастотні зміщення коливань карбонільних груп цих молекул, що пояснено виникненням резонансної взаємодії коливань відповідних карбонільних груп С 2=0 (РМИ) - Сб=0 (ТРН) і С 4=0 (РМ№) С2- 0 (ТРН). При цьому показано, що спостережуваний в експерименті частотний зсув може виникати тільки у випадку, коли комплекс формується як мінімум з 3 молекул. У випадку системи ТРН-ЕВ виявлено низькочастотні зміщення коливань карбонільних груп ТРН в 14 спектрах і високочастотні зміщення деформаційних коливань аміногрупи ЕВ в спектрах КР. Такі зміни в спектрах вказують на можливе утворення водневих зв’язків між донорноакцепторними групами цих молекул. Проте, враховуючи дані ЯМР про структури цих гетеродимерів, було зроблено висновок, що найбільш імовірно ці зв’язки формуються через молекули води - «водні містки». У випадку комплексів ТРН-РИТ і САР-ЕВ досліджені 14 і КР спектри показали відсутність міжмолекулярних водневих зв’язків, що також узгоджується з літературними даними. Для проведення додаткового аналізу структури отриманих гетероасоціатів було проведено моделювання цих систем методом МонтеКарло. Результати моделювання для комплексу РМК-ТРРІ показали можливе виникнення водних містків, що вносять суттєвий внесок в стабілізацію комплексу, проте ці результати суперечать одержаним ІЧ-спектрам, де не зафіксовано відповідних низькочастотних зсувів коливань карбонільних груп. У випадку комплексів ТРН-ЕВ, ТРИ-РИГ і САР-ЕВ в цілому результати моделювання підтвердили експериментальні дані і показали відсутність міжмолекулярних водневих зв’язків. Окремо обговорюється можливість утворення водних містків між донорно-акцепторними групами молекул гетерокомплексу, що складаються з ланцюжків довжиною від 1 до 6 молекул. У п ’ятому розділі окремо описуються прояви водневого зв’язку в коливальних спектрах комплексів досліджуваних молекул. Зокрема, у випадку комплексів РММ-ЕВ в 14 спектрах зафіксовано низькочастотний зсув коливань карбонільної групи С2= 0 молекули РМИ і підвищення інтенсивності, а в КР спектрах зафіксовано високочастотний зсув аміногрупи ЕВ. У випадку комплексів РММ-РШ7 в спектрах спостерігаються такі самі зміни для коливань карбонільної групи С 4=0 РМИ та аміногрупи ЕВ. Одержані зміни коливальних спектрів свідчать про утворення міжмолекулярного водневого зв’язку між
З
о

однією з карбонільних груп РІУПЧ та аміногрупою ЕВ. Обговорюється можливість утворення комплексу РММ-РЯР-РММ, в якому комплекс стабілізується водневими зв’язками за участі двох різних карбонільних груп РМИ (Со-О і С4=0). Ріа основі одержаних зсувів частот в коливальних спектрах досліджуваних гетерокомплексів виконано оцінку внеску, що дають водневі зв’язки в енергію стабілізації комплексу. Показано, що він може досягати 2530% від загальної енергії комплексу. Для ілюстрації одержаних експериментальних даних було проведено моделювання методом МС. Результати показали, що між молекулами гетероасоціату можуть утворюватися водні містки, які є важливими для стабілізації комплексу. Окрема увага приділена дослідженню утворення водневих зв’язків ЕВ з подвійною спіраллю ДРІК. Одержано КР спектри систем ЕВ-ДРІК при різних співвідношеннях концентрацій ліганду та ДНК. Виявлені зміни в спектрах при низькій концентрації ліганду вказують на формування водневих зв’язків між аміногрупами ЕВ та атомами кисню 0 5 ’ і 0 4 ’ остова макромолекули ДНК. При високих концентраціях ліганду відбувається перехід подвійної спіралі з В форми в Л-форму, що супроводжується витісненням ліганду назовні макромолекули. У цьому випадку також утворюються водневі зв’язки між аміногрупами ЕВ та цукро-фосфатним остовом ДНК. Серед одержаних у дисертації результатів найбільшу наукову цінність, на мою думку, мають наступні: • На основі результатів досліджень 14 і КР спектрів доведено існування водневих зв’язків в гетерокомплексах РМК-ЕВ, РМЇЧ-РІІР, і ТРН-ЕВ, які виникають між аміногрупами та карбонільними групами відповідних молекул комплексу. • Показано, що внесок водневих зв’язків у загальну енергію стабілізації комплексів РММ-ЕВ і РМ]Ч-РРІР може досягати 30%. • Показано відсутність водневих зв’язків між молекулами в гетероасоціатах РМИ-ТРН, ТРИ-РИІ7 і САР-ЕВ. • На основі спектрів КР показано, що при високих та низьких концентраціях ліганду в комплексах ЕВ-ДНК утворюються водневі зв’язки між аміногрупами ЕВ та донорно-акцепторними групами ДНК. Усі одержані результати детально проаналізовано. їх достовірність забезпечується застосуванням добре апробованих методів 14 та КР спектроскопії, методу п ’єзогравіметрії та розрахункових методів (Монте-Карло та теорії функціоналу густини). Висновки та наукові положення, зроблені на основі проведеного дослідження, є новими та обгрунтованими. Водночас аналіз дисертаційної роботи викликає ряд зауважень: 1. Усі досліджувані системи це водні розчини електролітів, що містять іони натрію. Наявність іонів металів може впливати на утворення комплексів досліджуваних молекул, особливо у випадку систем з РІУ П Ч Г, молекула якого має фосфатну групу. У нейтральному середовищі фосфатна група негативно заряджена і, у випадку самоасоціату, що складається з багатьох молекул РМІМ, такий макромолекулярний комплекс може мати
4

2.

3.

4.

поліелектролітні властивості. Враховуючи геометричні параметри комплексу самоасоціату РМ1Ч, за теорією Меннінга можна провести оцінки ступені нейтралізації поверхневого заряду. Така оцінка показує, що має відбуватися конденсація протиіонів, яка призводитиме до екранування заряду фосфатної групи на 50%. В дисертації вплив протиіонів не обговорюється. Пояснення високочастотних зсувів, що спостерігається в 14 спектрах ізоалоксазинового кільця РМИ при переході від нейтрального в слабокисле середовище, на основі квантово-хімічних розрахунків має протиріччя. У випадку коливальних мод 1501 см '1 і 1541 см '1 розрахункові дані дають, в основному, зменшення порядку зв’язків і абсолютних величин зарядів на атомах, а у випадку моди 1575 см"1 навпаки збільшення. Однозначний висновок про вплив такого перерозподілу зарядів і порядків зв’язків на знак, а, тим більше, величину частотного зсуву зробити важко. Деякі структури молекулярних комплексів у водному середовищі, які одержано за результатами моделювання методом Монте-Карло, не мають міжплощинного контакту (наприклад ТРН-ЕВ, рис. 4.10), що суперечить експериментальним даним. Також викликає питання щодо стабільності довгих водних ланцюжків між донорно-акцепторними групами молекул в комплексі, які було одержано методом Монте-Карло. Для роз’яснення даних питань було би добре провести моделювання цих систем методом молекулярної динаміки. Серед технічних зауважень слід відзначити занадто стисле описання методики квантово-хімічних розрахунків. На рисунку 4.2. лінія, що зображає суму спектрів РМІМ+ТРН, проходить вище, ніж це можливо, що, вочевидь, пов’язано з технічною помилкою при побудові графіку. В тексті зустрічаються русизми та неточності: на стр. 57 «силова постійна» краще писати «силова стала», на стр. 61, 64, 106 та в інших місцях «постійна Планка» краще вживати «стала Планка», на стр. 68 «щільність» має бути «густина».

Однак, наведені зауваження не ставлять під сумнів ні достовірності основних результатів роботи, ані зроблених на їхній основі висновків, та не впливають загальну на істотно позитивну оцінку роботи. Основні результати роботи повністю опубліковано в 6 статтях в провідних вітчизняних фахових наукових виданнях та апробовано на 11 наукових конференціях, симпозіумах та семінарах. Дисертація написана грамотною мовою і добре ілюстрована. Автореферат оформлено належним чином і дає повне уявлення про дослідження, що виконувалися в роботі. Зміст дисертації відповідає паспорту спеціальності 03.00.02 - біофізика (фізикоматематичні науки). Враховуючи актуальність теми, новизну, наукове та практичне значення одержаних результатів, вважаю, що дисертаційна робота «Механізми асоціації біологічно активних речовин та їх комплексоутворення з ДНК» відповідає
5

вимогам «Порядку присудження наукових ступенів», затверджених Постановою Кабінету Міністрів України від 24 липня 2013р. №567, щодо кандидатських дисертацій, а її авторка, Близнюк Юлія Миколаївна, без сумніву, заслуговує на присудження наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика (фізико-математичні науки).

Вчений секретар Інституту теоретичної фізики ім. М.М. Боголюбова НАН України, кандидат фізико-математичних наук

Підпис С.М. Перепелиці засвідч Заступник директора з наукової Інституту теоретичної фізики ім. М.М. Боголюбова НАН У краї доктор фізико-математичних наук

'

Л_ ,

В.І. Засенко

“З * *

18 січня 2018 р.

6