УДК: 616.36 – 002: 578. 891] – 07: 575. 22 (477, 87) ОСОБЛИВОСТІ ІМУНОЛОГІЧНОГО РЕАГУВАННЯ ОРГАНІЗМУ ПРИ НВV-ІНФЕКЦІЇ М.А. Тимкович1, В.П. Малий2, Т.І. Лядова3 1 Ужгородський національний університет, Україна 2 Харківська медична академія післядипломної освіти, Україна 3 Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна, Україна РЕЗЮМЕ В результаті проведених імунологічних досліджень вивчено динаміку синтезу прозапальних та протизапальних цитокінів у пацієнтів з гострою та хронічною НВV-інфекцією та на основі їх аналізу встановлено чотири типи імунологічного реагування організму на НВV: нормореактивний, дисоціативний, гіпореактивний та гіперреактивний. Одержані результати дозволяють рекомендувати необхідність комплексного обстеження хворих на ГГВ та ХГВ з визначенням маркерів активної вірусної реплікації (а саме ДНК НВV) та рівня основних регуляторних цитокінів. КЛЮЧОВІ СЛОВА: прозапальні цитокіни, протизапальні цитокіни, типи імунологічного реагування Сьогодні відомо, що характер імунної відповіді організму на антиген залежить від домінуючої участі клонів Т-лімфоцитів-хелперів (Тh) 1-го або 2-го типу, які різняться за продукуючими ними цитокінами і участю в стимуляції розвитку імунної відповіді по клітинному або гуморальному типах [1, 2, 3, 5]. Дослідженнями останніх років встановлено, що цитокіновий спектр при HBV-інфекції залежить від збалансованості ланок імунної відповіді організму, а порушення балансу продукції цитокінів Th1/Th2 клітинами відіграє важливу роль в імунопатогенезі HBV-інфекції. Більшість дослідників сходяться на думці, що переважна участь цитокінів, що продукуються Тh-2-лімфоцитами, асоціює з вірусною персистенцією та хронізацією процесу при HBV-інфекції, а Тh-1 – зі спонтанним одужанням при ГГВ та елімінацією збудника. Попри значні досягнення в цій галузі, багато питань характеру цитокінпродукуючої здатності імунокомпетентних клітин та їх імунопатогенетичних особливостях при гострій та хронічній HBV-інфекції і на сьогодні залишаються нез’ясованими, а літературні дані не містять однозначності та достатньої обґрунтованості. Цим і зумовлена актуальність та перспективність нашого дослідження [2, 4, 6]. Робота виконана згідно з планом науководослідної роботи Харківської медичної академії післядипломної освіти «Роль цитокінової регуляторної мережі у хворих на гострий вірусний гепатит В» № державної реєстрації 0103U004141. Метою нашого дослідження було дослідити синтез прозапальних (ІЛ-1β, ФНПα, ІЛ-6), регуляторного цитокіну ІЛ-2 та протизапальних цитокінів (ІЛ-4 та ІЛ-10) для встановлення типу імунологічного реагування у пацієнтів з гострою та хронічною HBV-інфекцією. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ Для досягнення поставленої мети дослідження нами систематизовано динаміку синтезу досліджуваних цитокінів у 36 хворих з середньотяжким та тяжким перебігом ГГВ та у 54 хворих з мінімальною та слабковираженою активністю ХГВ, які знаходилися на стаціонарному лікування в ОІЛ м.Ужгорода та гастроентерологічному відділенні ОКЛ м. Ужгорода. Вік хворих коливався від 19 до 65 років, серед них жінок було 41, чоловіків – 49 осіб. Контрольну групу складали 20 практично здорових осіб віком від 18 до 35 років. Діагноз ГГВ та ХГВ встановлювали з урахуванням комплексу клініко-епідеміологічних, лабораторно-інструментальних даних та підтверджували виявленням у сироватці специфічних серологічних маркерів ГВ (HBsAg, анти-HBcIgM, анти-HBcIgG, HBeAg, антиНВе) методом імуноферментного аналізу (ІФА) (ELISA) за допомогою тест-систем НВО «Диагностические системы» (Росія). На підставі негативних результатів індикації серологічних маркерів гепатитів А, С, D (анти-НАV IgM, анти-НСVсум., анти-НDV IgM) здійснювалося виключення мікстгепатитів. Сироваткові концентрації досліджуваних цитокінів: IJI-lβ, ΦΗΠ-α, ІЛ-6, ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ10 визначалися за допомогою тест-систем ООО «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург, Росія), користуючись інструкцією виробника з використанням твердофазного імуноферментного методу. Матеріалом для наших досліджень була сироватка крові хворих, яка при ГГВ отримана в розпалі хвороби і початку реконвалесценції, при хронічному ГВ – відповідно, при загостренні хвороби та клініко-лабора-торній ремісії. Усім хворим у динаміці хвороби здійснювалось УЗД органів черевної порожнини за допомогою ультразвукового сканера Ultima Pro-30 виробництва «Радмір» (м. Харків, Україна) з використанням датчиків частотою 3,5-6 МГц за стандартною методикою. Отримані результати досліджень статистично оброблені з використанням методів варіаційної статистики (середнє – М, його помилка – m) за допомогою програм «Exsel-2000» та «Statistika for Windows» (Statsoft Inc, США) на комп’ютері із процесором CPU Athlon 64-3200 Tray. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ пкг/мл 250 209,1 187,1 200181,1 162,1 150 100 50 0 ІЛ-1 ФНП ІЛ-6 ІЛ-2 ІЛ-4 ІЛ-10 29,5 221,1 190,2 129,1 136,1 100,1 105,1 25,3 20,7 18,4 Виявлені в динаміці хвороби зміни цитокінового синтезу у хворих на гострий та хронічний ГВ дозволили згрупувати прояви цитокінового дисбалансу і встановити різні типи імунологічного реагування організму на HBV-інфекцію. У ході аналізу отриманих результатів у хворих на ГГВ були виявлені чотири типи імунологічного реагування (рис.1, 2, 3): І – нормореактивний тип (вірогідне підвищення прозапальних та протизапальних цитокінів), ІІ – дисоціативний (високі показники прозапальних цитокінів на фоні низьких значень регуляторного ІЛ-2 та протизапальних цитокінів), ІІІ – гіпореактивний (низькі концентрації як прозапальних, так і протизапальних цитокінів) та ІV – гіперреактивний (високі концентрації як прозапальних, так і протизапальних цитокінів). пкг/мл 250 200 148,2 150 131,1 110,2 102,5 100 50 0 ІЛ-1 ФНП ІЛ-6 ІЛ-2 ІЛ-4 ІЛ-10 172,2 141,1 108,1 112,1 83,1 79,1 25,3 20,7 61,1 56,0 28,8 11,9 50,2 41,1 29,5 11,9 28,8 18,4 середньотяж кий перебіг ГГВ тяжкий перебіг ГГВ контрольна група А середньотяжкий перебіг ГГВ тяжкий перебіг ГГВ контрольна група В Рис. 1 . Динаміка цитокін ів у хвори х на ГГВ із н ормореактивним тип ом імунологічног о реагування у п еріодах розпалу (А) і реконвалесценц ії (В) При вивченні синтезу прозапальних та протизапальних цитокінів у хворих на ГГВ із нормореактивним типом імунної відповіді (рис. 1) виявлялися розбіжності середніх показників цитокінів у досліджуваних групах порівняно з контрольними рівнями і спостерігалося вірогідне підвищення концентрацій (в середньому у 5,2-7,7 разів) всіх досліджуваних цитокінів відповідно до тяжкості перебігу у розпалі ГГВ із тенденцією до вірогідного зниження їх рівнів у періоді реконвалесценції хвороби (р<0,05). У хворих на ГГВ із дисоціативним типом імунологічного реагування була встановлена низька продукція регуляторного ІЛ-2 та концентрація була досить низькою і в середньому у 2,5-3,5 рази перевищував показники контрольної групи, в той час як у хворих із нормореактивним типом рівні протизапальних ІЛ-4 і ІЛ-10, тоді як рівні прозапальних цитокінів (ІЛ-1β, ФНП-α та ІЛ6) підвищувалися пропорційно до ступеня тяжкості хвороби (рис. 2). У періоді розпалу при порівнянні середніх показників ІЛ-1β, ФНП-α та ІЛ-6 у хворих із дисоціативним та нормореактивним типами імунного реагування статистичної різниці не відмічалося (р>0,05), але їх показники значно перевищували відповідні рівні контрольної групи (р<0,05). Синтез ІЛ-2, ІЛ4 та ІЛ-10 у пацієнтів із дисоціативним типом імунної відповіді у періоді розпалу ГГВ (рис. 2А) теж підвищувався, але порівняно з відповідними даними у хворих із нормореактивним типом реагування їх останніх перевищували такі у групі контролю в середньому у 7-9 разів відповідно (р<0,05). У періоді реконвалесценції ГГВ у хворих із дисоціативним типом імунного реагування динаміка прозапальних цитокінів була такою ж, як у хворих із нормореактивним типом, що підтверджувалося вірогідним зниженням показників досліджуваних цитокінів відносно періоду розпалу хвороби (рис. 2В). Рівні ІЛ-1β, ФНП-α та ІЛ-6 продовжували перевищувати такі як в контрольній групі у середньому у 3–6 разів (р<0,05), тоді як в групі із нормореактивним типом імунного пкг/мл 250 225,1 200197,2 150 100 50 0 ІЛ-1 ФНП ІЛ-6 ІЛ-2 ІЛ-4 ІЛ-10 29,5 82,4 74,1 69,1 60,1 69,3 62,1 56,1 51,1 28,8 11,8 25,3 20,73 18,4 реагування – у 1,3-1,6 раза відповідно (р>0,05). У зазначений період у хворих із дисоціативним типом імунного реагування встановлено незначне зниження рівнів ІЛ-2, ІЛ-4 та ІЛ-10, порівняно з періодом розпалу захворювання (р>0,05), але їх концентрації продовжували перевищувати відповідні показники групи контролю (р<0,05) (в середньому у 2-2,5 раза). пкг/мл 250 200 179,1 151,1 150,1 132,1 150 100 50 0 ІЛ-1 ФНП ІЛ-6 ІЛ-2 ІЛ-4 ІЛ-10 середньотяжкий перебіг ГГВ тяжкий перебіг ГГВ контрольна група В 197,2 178,2 50,1 69,2 59,1 63,1 42,6 58,2 48,1 52,2 29,5 28,8 11,9 25,3 20,7 18,4 середньотяжкий перебіг ГГВ тяжкий перебіг ГГВ контрольна група А Рис. 2 . Динаміка цитокін ів у хвори х на ГГВ із ди соц іативним типом імун ологічн ого реаг ування у п еріодах розпалу (А) і реконвалесценц ії (В) Динаміка синтезу основних досліджуваних цитокінів у хворих на ГГВ при гіперреактивному типі імунологічного реагування представлена на рис. 3. Як видно з наведених результатів дослідження при гіперреактивному типі імунологічного реагування у хворих у періоді розпалу ГГВ виявлено достовірно високі рівні прозапальних та протизапальних цитокінів порівняно із нормореактивним типом (в середньому, у 1,5-2 рази) та групою контролю (в середньому у 8-10 разів) (р<0,05). В подальшому, у періоді пкг/мл 300 259,1 225,1 250 226,1 196,2 200 150 100 50 0 29,5 291,1 259,1 182,1 191,1 154,1 149,1 реконвалесценції хвороби середні показники досліджуваних цитокінів мали тенденцію до вірогідного зниження, але все ще продовжували перевищувати рівні не тільки групи контролю, а і групи із нормореактивним типом імунного реагування. Слід відмітити, що показники відзначалися статистичною вірогідністю як у групах порівняння залежно від тяжкості перебігу (р<0,05), так і порівняно з показниками при нормореактивному типі (р<0,05) та контрольною групою (р<0,05). пкг/мл 300 250 192,1 200165,1 164,2 136,1 150 100 238,1 201,1 133,2 139,2 98,1 104,2 25,3 20,7 18,4 105,2 92,1 28,8 90,1 81,2 11,85 25,3 20,7 18,4 50 0 ІЛ-1 29,5 28,8 11,9 ІЛ-1 ФНП ІЛ-6 ІЛ-2 ІЛ-4 ІЛ-10 ФНП ІЛ-6 ІЛ-2 ІЛ-4 ІЛ-10 середньотяжкий перебіг ГГВ тяжкий перебіг ГГВ контрольна група А середньотяжкий перебіг ГГВ тяжкий перебіг ГГВ контрольна група В Рис. 3. Динаміка цитокінів у хворих на ГГВ із гіперреактивним типом імунологічного реагування у періодах розпалу (А) і реконвалесценції (В) Аналізуючи динаміку цитокінового профілю у 54 хворих на ХГВ нами було виявлено різноспрямовані зміни синтезу прозапальних та протизапальних цитокінів, що дало підставу виділити два типи імунологічного реагування організму: І – дисоціативний (низькі показники прозапальних цитокінів та регуляторного ІЛ2 на фоні помірних значень протизапальних цитокінів) та ІІ – гіпореактивний (низькі концентрації як прозапальних, так і протизапальних цитокінів). При загостренні ХГВ у хворих із дисоціативним типом імунного реагування (рис. 4А) спостерігалася низька продукція прозапальних цитокінів та регуляторного ІЛ2, тоді як рівні протизапальних ІЛ-4 та ІЛ-10 вірогідно підвищувалися відповідно до активності процесу. Так, при мінімальній активності рівень ІЛ-4 перевищував у 5,7 разів, а ІЛ-10 – у 6 разів середні показники контрольної групи (р<0,05). У хворих з слабковираженою активністю рівень ІЛ-4 перевищував у 6,5, ІЛ-10 – у 7,5 разів контрольні показники (р<0,05). Показники ІЛ-1β, ФНП-α, ІЛ-6 та ІЛ-2 у хворих із дисоціативним типом реагування при пкг/мл 250 200 139,2 150 100 134,2 122,1 118,3 загостренні ХГВ також підвищувалися в середньому у 1,5-2 рази, дещо перевищуючи показники контрольної групи (р>0,05). У періоді ремісії ХГВ у хворих із дисоціативним типом імунного реагування (рис.4В) відмічена тенденція до незначного зниження, відносно періоду загострення, як прозапальних (р>0,05), так і протизапальних цитокінів (р>0,05) і їх показники продовжували перевищувати відповідні рівні групи контролю. Таким чином, при дисоціативному типі імунологічного реагування у хворих на ГГВ та ХГВ динаміка цитокінового профілю була різною: у пацієнтів на ГГВ було виявлено низькі концентрації регуляторного ІЛ-2, протизапальних ІЛ-4 та ІЛ-10 на фоні підвищених рівнів прозапальних цитокінів (ІЛ-1β, ФНП-α та ІЛ-6); у хворих на ХГВ встановлено низькі рівні прозапальних цитокінів та регуляторного ІЛ-2 на фоні підвищених показників протизапальних ІЛ-4 та ІЛ-10. пкг/мл 250 200 150 100 50 0 55,1 50,2 46,1 39,2 29,5 ІЛ-1 126,2 130,2 110,2 115,1 41,2 19,2 50,3 25,3 15,2 28,8 11,9 ІЛ-6 ІЛ-2 61,1 58,2 57,1 52,2 49,1 46,1 24,2 50 20,1 25,3 20,7 18,4 29,5 28,8 11,9 0 ІЛ-1 ФНП ІЛ-6 ІЛ-2 ІЛ-4 ІЛ-10 мінімальна активність слабковиражена активність контрольна група А 20,7 18,4 ФНП ІЛ-4 ІЛ-10 мінімальна активність слабковиражена активність контрольна група В Рис. 4 . Динаміка цитокін ів у хвори х на ХГВ із ди соц іативним типом імун ологіч н ого реаг ування у п еріодах загострення (А) і ремісії (В) У хворих на ГГВ як і у хворих на ХГВ із встановленим гіпореактивним типом імунологічного реагування синтез прозапальних та протизапальних цитокінів був низьким (рівні ІЛ-1β визначалися від 25,32 до 72,19 пкг/мл; ФНП-α – від 32,5 до 67,2 пкг/мл; ІЛ-6 – від 16,1 до 27,3 пкг/мл; ІЛ-2 – від 35,12 до 81,1 пкг/мл; ІЛ-4 – від 25,3 до 96,45 пкг/мл; ІЛ-10 – від 36,34 до 99,1 пкг/мл), показники коливались у межах значень контрольної групи і не відзначалися статистичною вірогідністю (р>0,05). ВИСНОВКИ Отримані результати досліджень доводять доцільність на сучасному етапі комплексного імунологічного обстеження хворих з НВV-інфекцією, що включає динамічне спостереження за синтезом регуляторних цитокінів, їх аналіз з встановленням типу імунологічного реагування організму, що зумовлено їх впливом на складні механізми імунопатогенезу хвороби. При середньотяжкому та тяжкому перебігу ГГВ встановлено чотири типи імунологічного реагування: нормореактивний, дисоціативний, гіперреактивний та гіпореактивний, які знаходяться у взаємозв'язку із генетичною структурою вірусу, клінічними проявами і наслідками хвороби. Нормореактивний тип імунологічного реагування характеризується вірогідним підвищенням прозапальних та протизапальних цитокінів, що корелює з ступенем тяжкості захворювання. При дисоціативному типі у хворих на ГГВ виявляється низький синтез ІЛ-2, ІЛ-4 та ІЛ10 на фоні підвищеного вмісту прозапальних цитокінів (ІЛ-1β, ФНП-α і ІЛ-6). При гіперреактивному типі встановлено вірогідні високі показниками всіх досліджуваних цитокінів, тоді як при гіпореактивному типі відмічено низький синтез прозапальних та протизапальних цитокінів, показники яких коливалися у межах контрольних значень. При мінімальній та слабковираженій активності ХГВ встановлено два типи імунологічного реагування: дисоціативний та гіпореактивний. У першому випадку ЛІТЕРАТУРА 1. 2. 3. 4. 5. 6. виявлено низькі рівні прозапальних цитокінів та регуляторного ІЛ-2 на фоні помірно підвищених концентрацій протизапальних цитокінів і синтез останніх корелював з активністю інфекційного процесу. У другому випадку показники всіх досліджуваних цитокінів були низькими і коливались в межах контрольних рівнів. Враховуючи отримані результати перспективним напрямком дослідження є медикаментозна корекція гіпореактивного, гіперреактивного та дисоціативного типів імунного реагування задля профілактики можливої хронізації процесу у хворих на ГГВ та неблагоприємних наслідків захворювання при ХГВ. Возианов А.Ф., Бутенко А.К., Зак К.П. Цитокины. Биологические и противоопухолевые свойства. К.:Наукова думка, 1998. - С. 5-53. Ройт А. Основы иммунологии (пер. с англ.). - М.:Мир, 1991. - 328с. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В. // Иммунология. - 2000. - № 1. - С. 61-64. Царегородцева Т.М., Серова Т.И. Цитокины в гастроэнтерологии. -М.:Анахарсис, 2003. - С. 50. Hollinger FB. et al. // Virology. Raven Press, New York. - 1990. - Р. 2171-2236. Milich D.R. // J.Viral Hepat. - 1997. - Vol. 4. - P. 25-30. ОСОБЕННОСТИ ИММУННОГО РЕАГИРОВАНИЯ ОРГАНИЗМУ ПРИ НВV-ИНФЕКЦИИ М.А. Тымкович1, В.П. Малый2, Т.В. Лядова3 1 Ужгородский национальный университет, Украина 2 Харьковская медицинская академия последипломного образования, Украина 3 Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина, Украина РЕЗЮМЕ В результате проведенных иммунологических исследований изучено динамику синтеза провоспалительных и противовоспалительных цитокинов у пациентов с острой и хронической НВV-инфекцией и на основании их анализа установлено типы иммунного реагирования организма при НВV: нормореактивный, диссоциативный, гипореактивный и гиперреактивный. Полученные результаты позволяют рекомендовать необходимость комплексного обследования больных с ОГВ и ХГВ с определением маркеров активной вирусной репликации (ДНК НВV) и уровня основных регуляторных цитокинов. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: провоспалительные цитокины, противовоспалительные цитокины, типы иммунного реагирования PECULIARITIES OF THE IMMUNOLOGICAL BODY REACTION AT HBV-INFECTION M.A. Tymkovich1, V.P. Maliy2, T.I. Lyadova3 1 Uzhgorod national university, Ukraine 2 Kharkov medical academy of postgraduate education, Ukraine 3 V.N. Karazin Kharkov National University, Ukraine SUMMARY As e result of the conducted immunological researches the dynamics of the pro-inflammatory and contrainflammatory cytokines synthesis in the pacients with acute and chronic HBV infection was studied and on the basis of their analysis the types of immunological body reaction at HBV were established: normally reactive, dissociative, hyporeactive and hyperreactive. The got results allow to recommend the necessity of complex investigation of patients with acute viral hepatitis B with determination of markers of active viral replikation (DNA HBV) and level of principal regulators cytokine. KEY WORDS: pro-inflammatory cytokines, contra-inflammatory cytokines, types of immunological reaction