Науковий вісник Ужгородського університету Серія Біологія, Випуск 21, 2007: 79–84 © Межжерін С. В., та ін., 2007

ГЕРПЕТОЛОГІЯ

УДК 575.1:597.828

ЭВОЛЮЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПОЛУКЛОНАЛЬНОГО ВОСПРОИЗВОДСТВА ГИБРИДНОЙ ФОРМЫ RANA KL. ESCULENTA (AMPHIBIA, RANIDAE)
С. В. Межжерин, С. Ю. Морозов-Леонов, О. Д. Некрасова, Ф. Ф. Куртяк, Д. А. Шабанов, А. В. Коршунов
Эволюционно-генетические аспекты полуклонального воспроизводства гибридной формы Rana kl. esculenta (Amphibia, Ranidae). — С. В. Межжерин1, С. Ю. Морозов-Леонов1, О. Д. Некрасова1, Ф. Ф. Куртяк2, Д. А. Шабанов3, А. В. Коршунов4. — Изучена изменчивость гена Ldh-B зеленых лягушек рода Rana: гибридной формы Rana kl.

leone2000@hotmail.com; 2 Ужгородский национальный университет, ул. Волошина, 32, Ужгород, 88000 Украина, 3 Биологический факультет Харьковского национального университета e-mail: kurtyak@bk.ru;

esculenta и родительского вида – озерной лягушки Rana ridibunda. Показано снижение уровня наследственной изменчивости гибридной формы сравнительно с родительским видом. Причиной этого предполагается полуклональное воспроизводство гибридной формы рекомбинации при мейозе. Ключевые слова: полуклональное наследование, мейоз, Rana kl. esculenta, гетерозиготность Адреса: 1 Институт зоологии НАН Украины, ул. Б. Хмельницкого, 15, Киев-30, ГСП, 01601 Украина; e-mail: morим. В.Н. Каразина, пл. Свободы, 4, Харьков, 61077, Украина, e-mail: d_sh@list.ru; 4НИИ Биологии Харьковского национального университета им. В.Н. Каразина, пл. Свободы, 4, Харьков, 61077, Украина, e-mail: alexey_korshunov@list.ru.

Evolutionary genetic aspects of the hybrid form Rana kl. esculenta (Amphibia, Ranidae) hemiclonal reproduction. — S. V. Mezhzherin1, S. Yu. Morozov-Leonov1, O. D. Nekrasova1, F. F. Kurtyak2, D. A. Shabanov3, A. V. Korshunov4 —

morleone2000@hotmail.com; 2 Uzhgorod national Univerity, Voloshin st., 32, Uzhgorod, 88000 Ukraine, e-mail: kurtyak@bk.ru; 3 Biology Department of V.N. Karazins` Kharkiv National University, Svobody sq., 4, Kharkiv, 61077, Ukraine, e-mail: d_sh@list.ru; 4 Biology Institute of V.N. Karazins` Kharkiv National University, Svobody

The Ldh-B gene variation was studied within the green frogs genus Rana: the hybrid form Rana kl. esculenta and the parental species – marsh frog Rana ridibunda. The decreasing of the heritable variation level within the hybrid form comparatively to the parental species was shown. The cause of it is assumed to be the hybrid form hemiclonal reproduction without the recombination. Keywords: hemiclonal inheritance, meiosis, Rana kl. esculenta, heterozygosity Address: 1 Institute of zoology NAN of Ukraine, B. Khmelnitsky st., 15, Kiev-30, GSP, 01601 Ukraine, e-mail:

sq., 4, Kharkiv, 61077, Ukraine, e-mail: alexey_korshunov@list.ru. Введение Целью нашего исследования была оценка эволюционно-генетических эффектов такого необычного способа воспроизводства, как полуклональное наследование. В настоящее время существует множество фактов, указывающих на первостепенное эволюционное значение рекомбинации при половом процессе [1, 2]. Мейотическое деление (включающее кроссинговер) является основным фактором, порождающим и/или поддерживающим генетическую изменчивость. Последняя является материальной основой эволюционного потенциала. Таким образом, биологические таксоны, воспроизводящиеся без нормального мейоза, являются весьма перспективной моделью для оценки эволюционных преимуществ полового размножения. Снижение уровня наследственной изменчивости в случае обнаружения его у асексуальных форм может быть критерием утраты эволюционного потенциала. Одним из вариантов воспроизводства без рекомбинации является полуклональное размножение, известное к настоящему времени для межвидовых гибридов у некоторых насекомых [3], рыб [4, 5], а также и для зеленых лягушек рода Rana [6]. Суть полуклонального воспроизводства состоит в наследовании лишь одного из родительских геномов. Гибридный генотип потомства в каждом поколении воссоздается заново за счет возвратных скрещиваний с родительским видом, чей геном не наследуется. Поэтому фактически наследуются гаплоидные генотипы одного из родительских видов. Сравнение уровня изменчивости наследуемого генома в норме и при полуклональном воспроизводстве позволит оценить

Sci. Bull. Uzhgorod Univ. (Ser. Biol.), 2007. Vol. 21

79

скорость потери изменчивости в отсутствие нормального полового процесса, сопровождающего генетической рекомбинацией. Съедобная лягушка Rana kl. esculenta была выбрана нами в качестве объекта для проведения подобного исследования. Известно, что съедобная лягушка является гибридом между прудовой Rana lessonae и озерной Rana ridibunda лягушками [7]. Характерной особенностью Rana kl. esculenta является как раз полуклональное наследование, при котором наследуется лишь один целостный родительский геном (в данном случае в этой роли выступает геном озерной лягушки) [8]. Рекомбинация родительских геномов у Rana kl. esculenta происходит лишь в популяциях бассейна Днепра и затрагивает преимущественно ген Ldh-B [9]. Эта особенность позволяет выделить внутри гибридной формы особей, гибридных по всем диагностическим генам (в том числе и гибридов F1), и рекомбинантов (заведомо не являющихся гибридами F1). Таким образом можно не только оценить ожидаемое снижение уровня генетической изменчивости у гибридов в целом, но и степень ее снижения в ходе многократного полуклонального воспроизводства. Материалы и методы Нами были проанализированы 65 выборок зеленых лягушек из 4 разных водосборных бассейнов Украины (Тиса, Днестр, Днепр и Северский Донец). Локализация выборок показана на рис. 1. Выборки объемом менее 5 животных не анализировались. Лягушки живьем перевозились в лабораторию, где анестезировались и умерщвлялись для приготовления проб. Методика приготовления проб и проведения электрофореза была описана ранее [10]. Видовой состав каждой выборки был описан с использованием традиционных обозначений. Так, сокращение LER обозначало выборку, состоящую из трех генетических форм: R. lessonae (L), R. kl. esculenta (E) и R. ridibunda (R) и т.д. Идентификация видовой принадлежности была проведена на основе электрофоретического анализа диагностических генов. Были проанализированы гены, диагностичность которых известна: гены, кодирующие В-субъединицу лактатдегидрогеназы (Ldh-B), митохондриальную форму аспартатаминотрансферазы (mAat), альбумин (Alb), эстеразу (Es-5) [10]. В качестве меры уровня наследственной изменчивости была выбрана ожидаемая гетерозиготность (Hexp). Для вычисления ожидаемой гетерозиготности был использован ген Ldh-B по причине легкой идентификации генотипов и высокого уровня полиморфизма в украинских популяциях Rana ridibunda [11]. Аллотриплоиды, обнаруженные в бассейне Северского Донца как ранее

[12], так и в ходе выполнения данного исследования, не учитывались. Результаты Видовой состав гибридных популяций. Популяции E-типа обнаружены только в бассейне Тисы (Закарпатье). Популяции, содержащие оба родительских вида (LER), найдены в бассейнах Днестра и Днепра. Популяции LE-типа отсутствуют в бассейне Северского Донца, а популяции ER-типа распространены повсеместно (табл. 1). Генетические формы зеленых лягушек. Гибридные лягушки представлены двумя генотипическими классами (табл. 1). Во-первых, во всех водосборных бассейнах обитают лягушки, гибридные по всем диагностическим генам (гибридыаллодиплоиды). Во-вторых, только в бассейне Днепра обнаружены особи, гибридные по всем диагностическим генам, кроме Ldh-B (гибридырекомбинанты). Уровень генетической изменчивости гена LdhB озерной лягушки у разных генетических форм. Различия уровня изменчивости гена Ldh-B между генетическими формами достоверны (рис. 2). Hexp для озерной лягушки равна 0,371±0,011, для аллодиплоидов 0,286±0,016 и для рекомбинантов всего 0,028±0,014, т.е. значения ожидаемой гетерозиготности соотносятся как 13 : 10 : 1 (P<0,001). Уровень генетической изменчивости гена LdhB озерной лягушки в разных водосборных бассейнах. Значения ожидаемой гетерозиготности гена Ldh-B у аллодиплоидов обнаруживают межбассейновые различия (рис. 3): Hexp низка в популяциях бассейнов Тисы, Днестра и Днепра (0,14– 0,25) и достоверно выше в популяциях Северского Донца (0,55) (P<0,01). В популяциях из этого бассейна значения Hexp для аллодиплоидов (0,55±0,11) и озерной лягушки (0,60±0,03) не показывают различий. В прочих водосборных бассейнах значения этого показателя достоверно (P<0,001) ниже для аллодиплоидов, нежели для озерной лягушки. Уровень генетической изменчивости гена LdhB озерной лягушки в популяциях разных типов. Уровень изменчивости гена Ldh-B у аллодиплоидов зависит от наличия в популяции особей родительского вида (рис. 4). В популяциях, где озерная лягушка отсутствует (E, LE), Hexp ниже (0,140,15), нежели в популяциях, где озерная лягушка обнаружена (LER, ER) (0,21-0,29). При этом различия между популяциями из этих двух групп недостоверны при сравнении E и LER (F=2,97, P>0,05). Между E и ER, LE и ER, LE и LER различия достоверны (P<0,05-0,001). В популяциях, содержащих озерную лягушку, Hexp у гибридов достоверно (P<0,001) ниже таковой у родительского вида.

Sci. Bull. Uzhgorod Univ. (Ser. Biol.), 2007. Vol. 21

80

Таблица 1. Значения ожидаемой гетерозиготности гена Ldh-B Rana ridibunda у трех генетических форм зеленых лягушек Украины Тип популяции R. esculenta рекомб. M m n Генетическая форма R. esculenta аллодипл. M m n M Rana ridibunda m n N

Бассейн Тисы E LE LER ER Суммарно – – – – – – – – – – 0 0 0 0 0 0,15 0,04 – 0,21 0,14 0,03 0,03 – 0,06 0,02 197 44 0 48 289 – – – 0,46 0,46 – – – 0,05 0,05 0 0 0 100 100 5 1 0 7 13

Бассейн Днестра E LE LER ER Суммарно – – – – – – – – – – 0 0 0 0 0 – 0,21 0,42 0,00 0,25 – 0,10 0,16 0,00 0,07 0 17 10 3 37 – – 0,38 0,63 0,61 – – 0,24 0,07 0,07 0 0 4 52 56 0 2 1 1 4

Бассейн Днепра E LE LER ER Суммарно – 0,00 0,06 0,00 0,03 – 0,00 0,03 0,00 0,01 0 62 64 17 143 – 0,17 0,21 0,28 0,21 – 0,03 0,03 0,04 0,02 0 122 254 117 493 – – 0,34 0,28 0,32 – – 0,01 0,02 0,01 0 0 1082 426 1508 0 8 19 15 42

Бассейн Донца E LE LER ER Суммарно – – – – – – – – – – 0 0 0 0 0 – – – 0,55 0,55 – – – 0,11 0,11 0 0 0 21 21 – – – 0,60 0,60 – – – 0,03 0,03 0 0 0 206 206 0 0 0 6 6

Украина в целом E LE LER ER Суммарно – 0,00 0,06 0,00 0,03 – 0,00 0,03 0,00 0,01 0 62 64 17 143 0,15 0,14 0,21 0,29 0,29 0,03 0,03 0,03 0,03 0,02 197 190 264 189 840 – – 0,34 0,41 0,37 – – 0,01 0,02 0,01 0 0 1086 784 1870 5 11 20 29 65

Примечание: n – число животных, N – количество выборок.

Обсуждение Уровень генетической изменчивости гена Ldh-B озерной лягушки у разных генетических форм. Существуют два объяснения снижения уровня изменчивости гена Ldh-B у гибридной формы сравнительно с родительским видом. Во-первых, в результате действия отбора возможна селективная

гибель гибридных особей, что приводит к уменьшению генетического разнообразия выживших. Во-вторых, не исключено, что в производстве гибридов участвуют далеко не все особи родительского вида. Точно так же можно объяснить практически нулевую изменчивость гена Ldh-B у гибридоврекомбинантов.

Sci. Bull. Uzhgorod Univ. (Ser. Biol.), 2007. Vol. 21

81

Рис. 1. Локализация выборок зеленых лягушек (объяснение в тексте)

0,50

Ожидаемая гетерозиготность

0,40

0,37 0,29

0,30

0,20

0,10 0,03 0,00 Озерная лягушка Аллодиплоиды Генотипические классы особей Рекомбинанты

Рис. 2. Уровень изменчивости гена Ldh-B озерной лягушки в украинских популяциях

Sci. Bull. Uzhgorod Univ. (Ser. Biol.), 2007. Vol. 21

82

0,80 Ожидаемая гетерозиготность

0,60

0,40

0,20

0,00 Тиса Днестр Днепр Донец Водосборные бассейны Рекомбинанты Аллодиплоиды Озерная лягушка

Рис. 3. Уровень наследственной изменчивости гена Ldh-B озерной лягушки в водосборных бассейнах Украины
0,50 0,40 0,30 Hexp 0,20 0,10 0,00 E LE LER ER Видовой состав Рекомбинанты Аллодиплоиды Озерная лягушка

Рис. 4. Ожидаемая гетерозиготность (Hexp) гена Ldh-B озерной лягушки на Украине Уровень генетической изменчивости гена Ldh-B озерной лягушки у разных генетических форм. Различия уровня изменчивости гена Ldh-B между генетическими формами достоверны (рис. 2). Hexp для озерной лягушки равна 0,371±0,011, для аллодиплоидов 0,286±0,016 и для рекомбинантов всего 0,028±0,014, т.е. значения ожидаемой гетерозиготности соотносятся как 13 : 10 : 1 (P<0,001). Уровень генетической изменчивости гена LdhB озерной лягушки в разных водосборных бассейнах. Значения ожидаемой гетерозиготности гена Ldh-B у аллодиплоидов обнаруживают межбассейновые различия (рис. 3): Hexp низка в популяциях бассейнов Тисы, Днестра и Днепра (0,140,25) и достоверно выше в популяциях Северского Донца (0,55) (P<0,01). В популяциях из этого бассейна значения Hexp для аллодиплоидов (0,55±0,11) и озерной лягушки (0,60±0,03) не показывают различий. В прочих водосборных бассейнах значения этого показателя достоверно (P<0,001) ниже для аллодиплоидов, нежели для озерной лягушки. Уровень изменчивости гена Ldh-B у аллодиплоидов зависит от наличия в популяции особей родительского вида (рис. 4). Уровень генетической изменчивости гена LdhB озерной лягушки в разных водосборных бассейнах. Сравнение зеленых лягушек из разных бассейнов показывает необычность состава популяционных систем зеленых лягушек в среднем тече-

Sci. Bull. Uzhgorod Univ. (Ser. Biol.), 2007. Vol. 21

83

нии Северского Донца [14], где зарегистрированы как гибриды, полуклонально передающие геном R. lessonae, так и триплоидные гибриды. Уровень генетической изменчивости гена LdhB озерной лягушки в популяциях разных типов. Анализ количественного видового состава гибридных популяций, проделанный нами ранее [13], показал, что между популяциями E и LE, а также между ER и LER типов не существует достоверных разрывов в частотах генетических форм. Проще говоря, все гибридные популяции зеленых лягушек объективно делятся на две группы: содержащие примесь озерной лягушки и не содержащие ее. Результаты, полученные в ходе выполнения настоящей работы, подтверждают эту гипотезу. В то время как в популяциях LE и E типов гибридизация родительских видов, судя по всему,
1. J . evol. Biol. – 1999, 12. – P. 1003–1167. 2. Biol. J. Lin. Soc. V.79: Issue 1, 2003. 3. Mantovani B., Scali V., Tinti F. Allozyme analysis and phyletic relationships of two new stick–insects from north–west Sicily: Bacillus grandii benazzii and B. rossius –grandii benazzii ( Insecta: Phasmatodea) // J . evol. Biol. – 1991, 4. – P. 279–290. 4. Cunha C., Coelho M. M., Carmona J. A., Doadrio I. Phylogeographical insights into the origins of the Squalius alburnoides complex via multiple hybridization events // Molecular Ecology. – 2004, 13. – P. 2807–2817. 5. Quattro J. M., Avise J. C., Vrijenhoek R. C. An ancient clonal lineage in the fish genus Poeciliopsis (Atheriniformes: Poeciliidae) // Proc. Nati. Acad. Sci. USA. – January 1992, Vol. 89. – PP. 348–352, . 6. Vorburger C. Non–hybrid offspring from matings between hemiclonal hybrid waterfrogs suggest occasional recombination between clonal genomes // Ecology Letters. – 2001, 4. – P. 628– 636. 7. Бергер Л. Является ли прудовая лягушка Rana esculenta complex обыкновенным гибридом? // Экология. –1976, №2. – C.37–43. 8. Vinogradov A. E., Borkin L. J., Günther R. Genome elimination in diploid and triploid Rana esculenta males: cytological evidence from DNA flow cytometry // Genome. – 1990, V.33. – P.619 – 627. 9. Морозов–Леонов С. Ю. Генетические процессы в гибридных популяциях зеленых лягушек Rana esculenta complex Украины. Автореф... дис. канд. биол. наук. Киев. – 1998. – 24 с.

не идет (уровень изменчивости гибридной формы относительно низкий), в популяциях LER и ER типов она скорее всего происходит (уровень изменчивости гибридной формы выше). Выводы Установлено, что в ходе полуклонального воспроизводства гибридной формы R. kl. esculenta в ряду поколений происходит многократное снижение уровня генетической изменчивости родительского генетического материала. Это подтверждает эволюционную значимость рекомбинации в ходе гаметогенеза и свидетельствует о тесной генетической зависимости данной гибридной формы от родительского вида.

____________________ 10. Межжерин С. В., Песков В. Н. Биохимическая изменчивость и генетическая дифференциация популяций озерной лягушки Rana ridibunda Pall. // Цитология и Генетика. – 1992, Т.26, №1. – С. 43–48. 11. Межжерин С. В., Морозов–Леонов С. Ю., Некрасова О. Д. Естественный перенос ядерных генов в гибридных популяциях зеленых лягушек Rana esculenta L., 1758 complex: анализ явления в пространстве и во времени // Генетика. –2004, Т. 40. № 12. – С. 1364–1370. 12. Borkin L. J., Korshunov A. V., Lada G. A., Litvinchuk S. N., Rosanov J. M., Shabanov D. A., Zinenko A. I. Mass occurence of polyploid green frogs (Rana esculenta complex) in Eastern Ukraine // Russian Journal of Herpetology. – 2004, V. 11, №. 3. – P. 194. 13. Морозов–Леонов С. Ю., Межжерин С. В., Некрасова О. Д., Куртяк Ф. Ф. Гибридные популяции европейских зеленых лягушек: обзор данных по количественному генетическому составу // Успехи совр. биол. – том 127, № 1, ЯнварьФевраль 2007. — С. 97–105. 14. Шабанов Д. А., Зиненко А. И., Коршунов А. В., Кравченко М. А., Мазепа Г. А. Изучение популяционных систем зеленых лягушек (Rana esculenta complex) в Харьковской области: история, современное состояние и перспективы // Вісник Харківського національного університету імені В.Н.Каразіна. Серія: біологія. – 2006., Випуск 3 (729). – С. 208–220.

Отримано: 15 січня 2007 р. Прийнято до друку: 1 квітня 2007 р.

Sci. Bull. Uzhgorod Univ. (Ser. Biol.), 2007. Vol. 21

84