ВІДГУК ОФІЦІЙНОГО ОПОНЕНТА на дисертацію Стороженко Галини Валеріївни «Роль сфінголіпідів у порушенні обміну кардіоліпіну та функціонального стану клітин і тканин у процесі старіння», подану до захисту спеціалізованої вченої ради К 64.051.17 Харківського національного університету імені В.Н.Каразіна МОН України на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 фізіологія людини і тварин Актуальність теми дисертації. Актуальність теми зумовлена тим, що кардіоліпін (КЛ) специфічний мітохондріальний ліпід, який зв'язує цитохром С з дихальним ланцюгом та є необхідним компонентом його функціонування; вивчення механізмів розвитку вікових порушень метаболізму кардіоліпіну в функціонально різних тканинах щурів, а також зв'язок цих процесів із функціональною активністю клітин та тканин щурів різного віку є актуальною задачею фізіології. Саме дослідження впливу різних факторів на вміст кардіоліпіну та визначення залежності фізіологічного стану клітин та тканин від його вмісту в процесі онтогенезу може призвести до розробки методів корекції багатьох фізіологічних станів, пов'язаних із порушенням функціонування електронно-транспортного ланцюгу мітохондрій. Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження, проведені в дисертаційній роботі, виконані у рамках фрагменту тем планової наукової роботи відділу фізіології Науково-дослідного університету інституту біології Харківського онтогенезу національного імені В. Н. Каразіна «Роль ліпідів, які беруть участь у сигнальній трансдукції, в модулюванні процесу старіння» (номер державної реєстрації теми 0106Ш01577), «Роль метаболітів сфінгомієлінового циклу в розвитку резистентності клітин до дії фізіологічних стимулів у процесі старіння» номер державної реєстрації теми 011Ш010555), «Роль сфінгомієліназ у віковому порушенні функціонального стану клітин і тканин та у розвитку передчасного старіння організму» (номер державної реєстрації теми 0115Ш00489). Наукова новизна одержаних результатів. Авторкою уперше показано, що індукція накопичення ендогенних церамідів і вплив на клітини і тканини, екзогенних церамідів різної природи призводить до зменшення рівня кардіоліпіну і зниження життєздатності клітин. У той час як, інгібітор синтезу цераміду - міріоцин дозволяє знизити індуковану доксорубіцином генерацію церамідів і нормалізувати вміст кардіоліпіну в клітинах молодих щурів. Уперше показано, що збільшення вмісту цераміду в мозку молодих тварин за допомогою введення Сіб-цераміду призводить до зниження рівня кардіоліпіну в гіпокампі та сприяє появі депресивно-подібних особливостей поведінки: ангедонії, зменшенню частоти грумінгу та реакцій догляду за собою, зростанню тривожності. Показано також, що вікове зниження рівня кардіоліпіну у тканинах серця, печінки та мозку 24-місячних щурів вдавалось нормалізувати до рівня 3-місячних тварин введенням ІЧ-ацетилцистеїну, який пригнічує активність нейтральної сфінгомієлінази. У той же час після внутрішньоназального введення старим щурам К-ацетилцистеїну - препарату, що дозволяє знизити рівень цераміду, також підвищення вмісту кардіоліпіну спостерігалось ознаки в мозку, а депресивно-подібні поведінки зникали. Доведено також, що додавання екзогенного кардіоліпіну до середовища культивування гепатоцитів, м'язової тканини і кори мозку старих щурів призводило до збільшення базального поглинання ними глюкози і синтезу глікогену та підвищення чутливості цих клітин до дії інсуліну. Практичне значення одержаних результатів. Полягає в тому, що Продемонстровані в даній роботі можливості корекції метаболізму кардіоліпіну за допомогою аліментарних факторів або модуляторів обміну сфінголіпідів можуть являти собою основу для пошуку нових лікарських препаратів і сприяти підвищенню ефективності комплексної терапії вікасоційованих захворювань. Крім того, фрагменти даної роботи впроваджені в навчальний процес кафедри фізіології людини та тварини біологічного факультету у рамках спеціального курсу: «Клітинні системи сигнальної трансдукції» для студентів 1-го року навчання в магістратурі. Ступінь обґрунтованості та достовірності наукових положень, висновків і рекомендацій, сформульованих у дисертації. Сформульовані Стороженко Г. В. основні наукові положення, висновки та практичні рекомендації обґрунтовані достатньою кількістю експериментальних даних та їх статистичною обробкою. Використані методи наукових досліджень є сучасними і відповідають вирішенню поставлених мети та задач, базуються на сучасних, адекватних та інформативних методах досліджень. Цифровий матеріал повністю грунтується на фактичних даних, які піддавалися математичному аналізу. Обсяг і структура дисертації Дисертація складається із анотації, вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результатів власних досліджень, висновків та списку використаних літературних джерел, який містить 318 найменувань. Робота викладена на 182 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 4 таблицями та ЗО рисунками. Текст дисертації, як за змістом, так і редакційно викладено та оформлено здобувачем якісно, назва роботи повністю відповідає меті та основному змісту дисертації. У вступі обґрунтовано актуальність проблеми, визначені мета, завдання, об'єкт і предмет дослідження, сформульовано наукову новизну, та практичне значення роботи, визначено особистий внесок автора, наведено дані про апробацію отриманих результатів. Розділ 1 (огляд літератури). В огляді літератури, який складається з трьох підрозділів на 20 сторінках викладені сучасні дані про структуру та функціональне значення кардіоліпіну. Представлені дані про особливості метаболізму кардіоліпіну у процесі онтогенезу та проаналізовані відомості щодо змін у структурі та обміні цього ліпіду при різних патологіях. Показано, що зміни метаболізму кардіоліпіну у процесі онтогенезу не до кінця вивчені, оскільки результати отримані різними дослідниками виявились суперечливими та залежали від об'єкту досліджень. Крім того, показана роль сфінголіпідів (зокрема цераміду) в процесі старіння і порушенні функціонального стану клітин і тканин. В кінці розділу зроблено висновок, та надані публікації щодо результатів дисертації. Розділ 2. (матеріали та методи ). Наведена характеристика об'єкту, схема експерименту та методи дослідження. Методики, які були використані є сучасними, коректними в плані вирішення конкретних завдань. Повнота викладення автором фізіологічних, біохімічних та статистичних методів є цілком достатньою для оцінки обґрунтованості експериментальних досліджень, їх сучасності з точки зору забезпечення якості проведення експериментів та можливості їх відтворення. Дослідження проводились на білих щурах - самцях 3-, 12-, 24- та 3032- х місячного віку, а також на вилученої тканині та органах щурів різного віку, та на виділених гепатоцитах і мітохондріях 3- та 24-місячних тварин. У дисертаційної роботі проводили дослідження вмісту кардіоліпіну в умовах вікового або експериментального накопичення церамідів в клітинах серця, печінки та мозку 3-, 12-, 24- та 30-32-місячних щурів. В експерименті були задіяні інтактні та дослідні тварини у яких накопичення церамідів в клітинах раціону та тканинах досягалося жирами, збільшенням або калорійності харчового або насиченими введенням доксорубіцину внутрішньошлунковим введенням 40 % етанолу. На другому етапі експерименту збільшення вмісту церамідів досягалося шляхом введення різних доз екзогенних С2-, СІ б-, або СІ 8-церамідів до клітин та тканин 3місячних щурів. Для корекції вмісту кардіоліпіну у представленої роботі використовували експериментальну калорійно-обмежену дієту, або вводили п-3 полі ненасичені жирні кислоти риб'ячого жиру і кверцетин, на тлі дії етанолу. У третій серії експериментів здобувач досліджував особливості поведінки 3- та 24-місячних щурів у різних поведінкових тестах («Відкрите поле», «Темний/світлий відсік», «Перевага до розчину сахарози», «Годування в незнайомій обстановці», «Іммобілізація за хвіст», «Сплеш-тест») при віковому збільшенні або експериментальному цераміду, зниженні вмісту кардіоліпіну та вмісту шляхом внутрішньоназального введення пальмітоїл-цераміду. Для вивчення можливості корекції рівню кардіоліпіну 24-місячним щурам вводили препарати іміпрамін, золедронову кислоту та ]Мацетилцистеїн. Для вивчення ефектів екзогенного кардіоліпіну на фізіологічний стан гепатоцитів, мозку та скелетних м'язів 24-місячних тварин до середи культивування додавали екзогенний кардіоліпін, після чого вивчали інсулінстимульований транспорт глюкози. Результати досліджень оброблені сучасними статистичними методами аналізу, є адекватними поставленим задачам. В розділі 3 (результати та обговорення) Дисертантом представлені результати власних досліджень, які складалися з чотирьох етапів. Здобувачем було доведено зниження рівня кардіоліпіну в серці, печінці та мозку щурів при старінні або при експериментальному накопиченні цераміду в клітинах. Встановлено зниження вмісту кардіоліпіну в м'язової тканині серця 3-місячних щурів після перфузії цього органу Сіб-церамідом та в гепатоцитах молодих щурів при культивуванні клітин у присутності екзогенних С2-, СІ 6-, СІ 8-церамідів, або препаратів які індукують накопичення цераміду - пальмітинової кислоти та доксорубіцину. В той же час інгібітор серинпальмитоїлтрансферази міріоцин, попереджуючий накопичення цераміду, нівелював ефекти доксорубіцину на гепатоцити, знижуючи рівень цераміду та нормалізував вміст кардіоліпіну к клітинах молодих щурів. В ході експерименту дисертант виявила, що зменшення вмісту кардіоліпіну в гіпокампі цераміду, 3-місячних щурів, викликане введенням СІ 6появою депресивно-подібних розладів супроводжувалось поведінки щурів, подібних до спостережуваних у щурів старечого віку: зростанням тривожності, пригніченням локомоторної та дослідницької активності, ослаблення інстинктів догляду за собою. У ході дослідження впливу інгібітору нейтральної сфінгомієлінази - ІчГацетилцистеїну, було виявлено що, знижений рівень кардіоліпіну в печінці, серці та мозку експериментальних тварин 24-місячного віку, відновлювався до такого в тканинах 3-місячних щурів та призводив до корекції порушень у поведінці щурів. Здобувачем Стороженко Г. В. було доведено, що внесення екзогенного кардіоліпіну до середовища інкубації клітин печінки, кори мозку або литкового м'язу 24-місячних щурів, або гепатоцитів 3-місячних щурів, попередньо інкубованих з доксорубіціном або Сіб-церамідом, підвищує чутливість цих клітин до дії інсуліну: збільшує базальне та гормон- стимульоване поглинання ними глюкози і синтез глікогену. Цей факт здобувач, пояснює, як відновлення фізіологічного стану клітин та тканин старих тварин. Аналіз та узагальнення результатів викладено відповідно до послідовності завдань роботи та розділів власних досліджень. Висновки узагальнюють результати досліджень, є обґрунтованими та відображають основні напрями в цій галузі. Вони викладені логічно, що свідчить про досягнення при розв'язанні поставлених завдань та мети роботи. З огляду на прорецензований матеріал можна зазначити, що мета дисертаційної роботи досягнута, а завдання досліджень виконано повною мірою. Отже, дисертаційну роботу можна вважати завершеною. Робота виконана на сучасному науково-методичному рівні і заслуговує позитивної оцінки. Повнота викладу матеріалів дисертації в опублікованих наукових працях та авторефераті. За результатами досліджень, наведених в дисертаційній роботі, опубліковано 24 наукових праці, з яких: 8 статей (2 статті у виданнях, які входять до переліку наукових фахових видань України, З статті у виданнях, що входять до міжнародних наукометричних баз, З статті, які додатково відображають зміст дисертації) та 16 тез доповідей в збірниках матеріалів вітчизняних та міжнародних з'їздів і конференцій. Опубліковані роботи відповідають вимогам щодо результатів дисертацій на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук. Автореферат має всі необхідні розділи та за змістом повністю відповідає основним положенням і висновкам, наведеним у дисертації. Недоліки дисертації та автореферату щодо їх змісту та оформлення. Дисертація та автореферат здобувача викладені українською мовою з дотриманням наукового стилю. їх оформлення в цілому відповідає сучасним вимогам МОН України, щодо викладання, об'єму, структури, посилань на джерела літератури. Є деякі помилки, перелік яких передано авторці. Також є деякі зауваження та запитання. Зауваження: Основним недоліком вважаю недостатньо підкреслене практичне значення отриманих даних: наприклад, отримані результати щодо корекції пошкоджень, викликаних доксорубіцином широко вживаним цитостатиком, належать до дуже важливих результатів, які б потрібно було патентувати. Запитання: Що таке ізоформи кардіоліпіну (стор.ЗЗ)? Поясніть будь ласка зв'язок між синтезом кардіоліпіну і церамідів, вплив на ці процеси сфінгомієлінази. Як Ви визначали інтенсивність синтезу глікогену? Висновок про відповідність дисертації встановленим вимогам. Дисертаційна робота Стороженко Галини Валеріївни «Роль сфінголіпідів у порушенні обміну кардіоліпіну та функціонального стану клітин і тканин у процесі старіння», є самостійною, завершеною науково-дослідною працею, що містить фундаментальні дані про особливості метаболізму кардіоліпіну у експериментальних тварин різного віку та залежність функціонального стану клітин та тканин від вмісту цього ліпіду. Таким чином, дисертація за своєю актуальністю, науковою новизною отриманих результатів, теоретичною і практичною цінністю відповідає вимогам п. 11 « Порядку присудження наукових ступенів затвердженого постановою КМУ № 567 від 24 липня 2013р. Офіційний опонент: професор кафедри хімії Національного технічного університету «Дніпровська політехніка» МОЗ України доктор біологічних наук, професор Штеменко Н. І.