Спектральные характеристики красных флуоресцентных белков, изменяющих спектр флуоресценции во времени

Abstract

Изучены спектральные характеристики трёх мономерных флуоресцентных белков - флуоресцентных таймеров (ФТ), созданных из исходного белка mCherry. Основной особенностью ФТ является способность изменять свою флуоресценцию с голубой на красную во времени. Полученные варианты характеризуются большим (Б), средним (С) и малым (М), временем созревания хромофора от голубого к красному. Время перехода от голубой флуоресценции к красной обратнопропорционально температуре. При температуре 370 C, максимумы голубой флуоресценции наблюдаются через 0,25, 1,2 и 9,8 часа для очищенных БФТ, СФТ и МФТ, соответственно. Полумаксимумы красной флуоресценции у этих белков наблюдаются через 3,9; 7,1 и 28 часов. У всех трёх вариантов ФТ пики возбуждения и флуоресценции для голубых форм равны 403 нм и 583 нм, а для красных форм – 466 нм и 606 нм соответственно. Флуоресценция всех изученных форм ФТ имеет высокую pH- стабильность в области рН от 4,5 до 7,5 со значением pKa, соответственно, около 3,0 для голубых и 4,1-4,7 для красных форм. Молярные коэффициенты экстинкции и квантовые выходы голубых форм ФТ находятся в пределах 33400-49700 M-1cм-1 и 0,30-0,41, соответственно Коэффициенты экстинкции красных форм ФТ выше, чем для голубых, и варьируют от 75300 M-1cм-1 у БФТ до 84200 M-1cм-1 у МФТ. Квантовые выходы красных форм ФТ находятся в пределах 0,05-0,09. Флуоресцентные свойства исследованных вариантов ФТ позволяют изучать процессы с существенно отличающимися временными характеристиками. Исследованные ФТ можно также использовать при создании пар с зелёными флуоресцентными белками для флуоресцентного индуктивного переноса энергии от голубой формы на зелёную, или от зелёной на красную, что расширяет возможности многоцветной флуоресцентной внутриклеточной детекции.